MICROSCOPIOS

¿Qué es un microscopio?

Los microscopios son dispositivos compuestos de partes específicamente diseñadas con la finalidad de conseguir una visión ampliada de las cosas. Esto permite a un espectador, experimentar una vista muy cercana y en tamaño adecuado de estructuras diminutas, a fin de realizar investigaciones y/o análisis.

La capacidad de funcionamiento de los microscopios, se debe a que han sido construidos con componentes especialmente diseñados para alcanzar altos niveles de aumento visual. En consecuencia, permiten apreciar objetos y especímenes muy pequeños, al punto de que el observador pueda distinguir sus diferencias estructurales.

¿Qué es la microscopia?

La microscopia puede ser definida como la observación de elementos u objetos de muy pequeñas dimensiones, mediante la utilización de grandes aumentos. La medicina y otras especialidades tienen como aliada a la microscopia. Esto en razón de que les permite la visualización y análisis de compuestos, materiales, tejidos, células y microorganismos.

Magnificación o aumento

Prácticamente todas las personas coincidirán en que cuando queremos apreciar con mayor detalle un objeto, lo que hacemos es acercarlo lo más posible hacia nuestros ojos. Lo que sucede es que con dicho acercamiento se incrementa el ángulo que se subtiende en el ojo, dando así la apariencia de mayor tamaño. Pero, si acercamos demasiado el objeto en cuestión, nuestro ojo será imposibilitado de formar una imagen clara. Ahora, si interponemos un lente amplificador o lupa entre el objeto y nuestro ojo, se permite la formación de una imagen virtual que puede ser apreciada por el observador.

La menor distancia a la que el ojo humano puede generar una imagen virtual clara es de aproximadamente 25cm. Sin embargo, esto también depende de la edad del individuo u observador. Así, mientras más se envejece, mayor es la distancia necesaria entre los ojos y el objeto observado. Es justamente aquí donde las lupas o lentes de aumento son de gran ayuda, en razón de que suplen de forma efectiva la deficiencia descrita.

Existe una relación directa entre la capacidad de aumento o ampliación y el campo de visión o tamaño visible del objeto. A esto se lo denomina “geometría del sistema óptico”. Se puede encontrar un valor de trabajo para el poder de aumento de una lente. Para esto, se divide la distancia mínima de visión clara para la distancia focal de la lente, que es la distancia desde la lente hasta el plano en el que se enfoca la luz entrante. Así, por ejemplo, una lente con una distancia mínima de visión clara de 25cm y una distancia focal de 5cm, tendrá un poder de aumento de aproximadamente de 5 veces o 5X.

Algo a tomar en cuenta, es que si el diámetro de la lente de aumento es suficiente para igualar o exceder el diámetro de la pupila del ojo, la imagen virtual que se observa parecerá tener sustancialmente el mismo brillo que el objeto original. Entonces, el campo de visión de la lupa o lente, vendrá determinado por la medida en que la ésta supere el diámetro de trabajo y también por la distancia que separa la lente del ojo. Eso sí, la claridad de la imagen virtual ampliada dependerá de las aberraciones presentes en la lente, su contorno y la forma en que se utilice.

Capacidad de amplificación de los microscopios

La capacidad de amplificación de un microscopio, puede ser definida como una relación de tipo adimensional. Esta se expresa en base al número de veces que el dispositivo es capaz de agrandar el tamaño del objeto visualizado. Por ejemplo, 100X significa que la imagen observada a través del microscopio ha logrado una amplificación de 100 veces su tamaño original.

Resolución de un microscopio

La resolución de un microscopio se puede definir como una medida del más mínimo detalle de la imagen respecto del objeto observado. La resolución se expresa en unidades lineales, generalmente micrómetros “μm” (millonésima parte del metro).

Tipos de lentes o aumentos

Existe una amplia variedad de lentes o aumentos disponibles. Los elementos determinantes para la selección de tales lentes en un microscopio o cualquier sistema óptico, son generalmente la potencia y aplicación requeridas.

Para requerimientos bajos de ampliación, del orden de 2X a 10X, es recomendable una lente doble convexa simple. Ahora, se puede obtener una mejoría considerable de la imagen, si se trata de una lente con superficies asféricas específicas, como una lente de plástico. Tales lentes reducen la distorsión y se usan especialmente para requerimientos de ampliación de 10X a 50X.

Una mejora en la distorsión es también posible, mediante el uso de dos lentes simples, generalmente de tipo plano-convexas. Este tipo de lentes se basan en el ocular del telescopio Huygenian. En dicho ocular, la aberración cromática lateral se corrige separando los elementos a una distancia focal. Dado que las propiedades de imagen son proporcionadas y compartidas por dos componentes, la aberración esférica y la distorsión de la lente se reducen considerablemente con respecto a las de una lente simple de la misma potencia.

También está la lente Coddington, la cual combina dos elementos en uno solo más grueso, con un surco cortado en el centro del elemento para seleccionar la porción de la luz de imagen con las aberraciones más bajas. Se trata de un diseño relativamente simple y económico. Sin embargo, como aspecto negativo, tenemos que su distancia de trabajo no es muy corta.

Existen versiones de lentes más complejas como las de Steinheil o Hastings. Estas utilizan tres o más elementos para lograr una mejor corrección de las distorsiones y las aberraciones cromáticas.

Por otra parte, también podemos encontrar sistemas ópticos que hacen uso de espejos. Los microscopios de reflexión, por ejemplo, amplían las imágenes a través de espejos cóncavos en lugar de lentes convexos. Estos alcanzaron su punto máximo de perfección en torno al año 1.947 gracias al físico británico C.R. Burch, quien fabricó una serie de instrumentos gigantes que utilizaban rayos ultravioleta. En los equipos en cuestión, se usa un reflector que inhibe la aberración cromática, y la distorsión y la aberración esférica se controlan mediante la introducción de un espejo de aumento asférico cuidadosamente contorneado. Los microscopios de reflexión actuales se limitan a instrumentos analíticos que utilizan rayos infrarrojos.

Aberraciones cromáticas

Básicamente, las aberraciones cromáticas son distorsiones ópticas provocadas por la imposibilidad de una lente para enfocar todos los colores en un único punto de convergencia.

Son varias las aberraciones que influyen en la nitidez o la calidad una imagen. Las aberraciones cromáticas por ejemplo, producen franjas de color alrededor de las regiones de alto contraste de la imagen. Esto se debe a que las longitudes de onda de luz más largas, como las de luz roja se enfocan en un plano ligeramente más alejado de la lente que las longitudes de onda más cortas como las de la luz azul.

Asimismo, tenemos la aberración esférica, la cual genera una imagen en la que el centro del campo de visión está enfocado sin que la periferia lo esté. Esto se debe generalmente al uso de lentes con superficies esféricas. En este caso, la distorsión produce imágenes curvas a partir de líneas rectas en el objeto. El tipo y grado de distorsión visible está íntimamente relacionado con la posible aberración esférica en la lupa y suele ser más grave en lentes de alta potencia.

Las aberraciones de una lente suelen incrementarse a medida que la apertura relativa (diámetro del trabajo dividido para la distancia focal) aumenta. En consecuencia, habrá que decidir si se prefiere una distancia focal corta, que permite una alta ampliación pero campo de visión pequeño, o una distancia focal larga, que permite una ampliación baja pero con un campo de visión lineal mayor.

Corrección de las aberraciones cromáticas

La AN (apertura numérica del objetivo) y la complejidad del objetivo se incrementan a medida que su capacidad de aumento sube. Los objetivos de baja ampliación, del orden de 2X a 5X, son generalmente lentes de dos elementos. Se pueden usar vidrios crown y flint ordinarios con IR (ínice de refracción) relativamente bajo y alto, respectivamente, a fin de corregir la aberración esférica y cromática.

Para objetivos con alta capacidad de aumento del orden de los 10x, la AN requerida aumenta a 0,25 y es necesario un tipo de lente más complejo. La mayoría de los objetivos de microscopio de este aumento utilizan un par de dobletes separados que comparten el poder de refracción. La corrección de la aberración esférica se consigue fácilmente, pero se obtiene una aberración cromática residual cuando se utilizan gafas ópticas normales para los elementos de la lente. Si bien es cierto, que para la mayoría de las aplicaciones ópticas, esto no es relevante, la verdad, es que para objetivos críticos con aumentos superiores a los 25X, esta aberración es visible como borrosidad cromática. La corrección de esta aberración residual se logra mediante el uso de vidrios ópticos especiales cuyas propiedades de dispersión varían de los vidrios normales. Solo hay unos pocos vidrios o materiales cristalinos que son útiles para este propósito. Los objetivos que utilizan estos lentes especiales se denominan apocromáticos y Abbe, mismos que se introdujeron por primera vez en la década de 1.870.

Finalmente, es importante tener en cuenta que los objetivos convencionales no producen una superficie de imagen plana. Ahora, la curvatura de campo generalmente tiene poca importancia en el uso visual del microscopio. Esto debido, a que el ojo tiene una capacidad de acomodación razonable cuando examina la imagen. Sin embargo, la curvatura de campo sí es un problema para los sistemas de imágenes. Para estos sistemas se han diseñado objetivos especiales con lentes de campo plano.

Óptica del microscopio

La óptica es la ciencia que estudia la luz. Se considera una de las ramas más antiguas de la física. El concepto en el cual se basa la óptica geométrica está en torno al rayo luminoso. Entendido como la trayectoria que siguen las partículas materiales emitidas por los cuerpos luminosos sin que importe la naturaleza de la luz.

Si abordamos el tema de la óptica de los microscopios, encontraremos algunas limitaciones geométricas. La primera tiene que ver con lo que se conoce como resolución alcanzable, que es la distancia más pequeña a la que se pueden ver dos puntos. Esto generalmente se establece por la capacidad del ojo para discernir los detalles, así como por la física básica de formación de imágenes.

Ahora, hay varios factores que determinan la capacidad que tiene el ojo humano para distinguir los detalles, los más relevantes, el grado de iluminación y grado de contraste entre las regiones claras y oscuras de un objeto. En condiciones de luz razonables, el ojo humano normalmente es capaz de ver dos puntos de alto contraste si subtienden un ángulo visual de al menos un minuto. Así que, a una distancia de visualización nominal de 25cm, los puntos deben estar separados por al menos 0,1mm para que el ojo asuma que están separados. Ahora, si utilizamos una lupa de mano que provea una ampliación de 10 veces, el observador podrá visualizar dos puntos separados algo así como 0,01mm. Mientras que, en el mismo ejemplo, pero con un microscopio compuesto de 100X de aumento, el mismo observador podría distinguir dos puntos separados por solo 0,001mm.

En el ejemplo anterior, se podría deducir a priori, que con el uso del microscopio compuesto se generan definitivamente las mejores circunstancias de visualización. Ahora, por supuesto que es así, sin embargo, también es cierto que existe una complicación relacionada con los lentes de aumento que forman el microscopio. Esto es, que cuando las dimensiones de los detalles se acercan a la longitud de onda de la luz, se debe considerar el efecto de la difracción que se ejerce sobre el ojo.

Entremos un poco más en detalle. La resolución y la capacidad de captación de luz de un microscopio están determinadas por la apertura numérica del objetivo. Dicho factor es denominado como “AN” y se define como el seno de la mitad del ángulo del cono de luz de cada punto del objeto que puede ser aceptado por el objetivo, multiplicado por el índice de refracción “IR” del medio en el que está sumergido el objeto. En consecuencia, la AN aumenta a medida que la lente se hace más grande o aumenta el IR. Los valores típicos para el rango de AN del objetivo del microscopio van desde 0,1 para objetivos de bajo aumento hasta 0,95 para objetivos secos y 1,4 para objetivos de inmersión en aceite.

En cuanto al límite de resolución, esta se establece por la longitud de onda de la luz y la NA. La resolución se puede mejorar aumentando la NA de una lente o usando luz con una longitud de onda más corta. En un objetivo de inmersión, la longitud de onda efectiva de la luz se reduce por el índice de refracción del medio dentro del cual reside el objeto que se desea visualizar. El uso de técnicas de imagen por inmersión mejora las capacidades de resolución de un microscopio.

Por otra parte, el cuerpo del microscopio incluye una estructura tubular que separa al objetivo del ocular, asegurando una alineación óptica contínua. Por supuesto, la longitud de dicho tubo respeta ciertos estándares, los mismos que tienen que ver con la distancia antropométrica entre la altura de la mesa de soporte para el microscopio y la posición de los ojos del observador. Un microscopio también incorpora un elemento giratorio denominado revólver. Su función, es permitir el intercambio de objetivos de diferentes capacidades de ampliación, asegurando una posición correcta.

Para la mayoría de los usos se ha aceptado una longitud de tubo de cuerpo estándar, que va desde el extremo superior del objetivo hasta el extremo del ocular del tubo, de 160mm. Sin embargo, en los microscopios metalográficos tal longitud se extiende hasta los 250mm. Los objetivos del microscopio están diseñados para minimizar las aberraciones en la longitud de tubo especificada. En consecuencia, el uso de otras distancias afectará el balance de aberraciones para objetivos de gran aumento. Por lo tanto, el enfoque del microscopio tradicional requiere mover el objetivo, el tubo y el ocular como una única unidad rígida. Esto se consigue con un mecanismo que permite que el objetivo y el ocular, se acerquen o se alejen de la muestra.

En cuanto a los portaobjetos de un microscopio, estos se han fijado con unas dimensiones de 7,5cm X 2,5cm. Los portaobjetos acogen la muestra, misma que generalmente se sumerge en un material cuya IR coincida con el del portaobjetos, para luego cubrirse con un cubreobjetos delgado.

Por su parte, el escenario mecánico en el que se encuentra la corredera está equipado con un par de controles que cuentan con una disposición de piñón y cremallera. Tal mecanismo permite que el portaobjetos de vidrio se deslice de izquierda a derecha, y hacia adelante y atrás, por sobre la platina. Así, se posibilita la inspección de la muestra. Eso sí, hay que tener en cuenta, que mientras disminuye la profundidad del enfoque del objetivo, se incrementa la precisión del movimiento de la corredera. Entonces, para objetivos de AN elevada, la profundidad del foco resulta muy pequeña, del orden de 1 o 2μm. En consecuencia, es fácil de comprender que el mecanismo debe asegurar un movimiento bastante sensible y preciso.

El tema del enfoque de un microscopio es por demás importante, tanto así, que los mecanismos encargados de tal función han ido evolucionando hasta garantizar una alta precisión. Existen incluso diseños que no cuentan con un mecanismo deslizante para el tubo del cuerpo del microscopio. Tales versiones, incluyen controles que ajustan el movimiento tanto vertical como el lateral de los componentes involucrados en el enfoque.

Partes del microscopio

Cabezal

El cabezal se ubica en la parte superior del microscopio. Generalmente se trata se una pieza con la capacidad de girar 360 grados, misma que aloja los elementos que constituyen el sistema óptico, como son: los oculares, la derivación trinocular y los prismas.

Oculares

Los oculares son los emenentos del microsopio que permiten que el observador examine o visualice la imagen. La capacidad de aumento de un ocular generalmente no supera las 10X (aunque en algunos equipos se está popularizando el uso de oculares de 25X). El campo de visión es entonces de unos 40° en total, un valor conveniente para un diseño óptico relativamente simple. El observador coloca el ojo en la pupila de salida del ocular, es decir, en el punto en el que se juntan los rayos de luz que salen del ocular. En la mayoría de los casos, está presente un relieve ocular de aproximadamente 1cm. Cuando tal relieve ocular es demasiado corto, se dificulta la visualización para los observadores que usan anteojos correctivos.

Derivación trinocular

Esta derivación es en realidad un tercer ocular, el cual está disponible en versiones denominadas “microscopios trinoculares”. Su función es permitir que se coloque un dispositivo de recolección de imagen y/o video, como por ejemplo una cámara digital. El propósito es que sea posible la visualización de las imágenes a través en un monitor, o la captura de las mismas en forma de archivos para su uso posterior, análisis o transferencia.

Tubo

El tubo es una estructura generalmente de forma cilíndrica, la cual forma parte del cabezal del microscopio y que contiene a los objetivos y oculares. Internamente es de color negro, a fin de no generar reflejos que interfieran con el paso de los rayos luminosos. Dependiendo del tipo de microscopio, también puede encontrarse unido al brazo a través de un mecanismo de cremallera para ajustar el enfoque.

Objetivos

La óptica del objetivo del microscopio se define por la distancia focal AN, y el campo de visión. Los objetivos que han sido corregidos por aberraciones se definen aún más por los requisitos de longitud de onda y la longitud del tubo del cuerpo del microscopio.

Los fabricantes de microscopios y sus respectivas partes, proporcionan lentes de objetivo con aumentos estándar que generalmente van de 2X a 100X. La distancia focal del objetivo es inversamente proporcional al aumento. En la mayoría de los microscopios modernos, dicha distancia focal es igual a la longitud del tubo dividida para el aumento.

Otro factor de relevancia es el campo de visión del ocular, mismo que por lo general se establece en un tamaño estándar de aproximadamente 20mm de diámetro. Posteriormente, el campo de visión del objetivo se ajusta en un rango de 10mm para un objetivo con un aumento de 2X. En caso de tratarse de un aumento de 100X se ajustará en un rango de 0,2mm. Como resultado, el campo de visión angular es de unos 7° para todos los objetivos.

Objetivos secos

Los objetivos secos, son aquellos que trabajan con el aire entre la muestra y la lente del objetivo.

Objetivos de inmersión de aceite

Un objetivo de inmersión de aceite, es aquel que requiere un líquido, generalmente un aceite, cuyo IR debe ser igual al del vidrio. De esta forma se consigue que ocupe el espacio entre el objeto y el elemento frontal del objetivo.

Objetivos de gran ampliación

Los objetivos de gran ampliación o alta potencia, plantean varios problemas de diseño. Así tenemos que, la distancia focal de un objetivo disminuye a medida que aumenta la AN y el poder de aumento. La distancia de trabajo o la distancia desde el frente del objetivo hasta la parte superior de la diapositiva, es más corta para los objetivos de mayor poder.

Además, la necesidad de usar elementos adicionales en el sistema de lentes para grandes aumentos acorta aún más la distancia de trabajo a solo 10 a 20 por ciento de la distancia focal. En consecuencia, un objetivo de 40X con una distancia focal de 4mm puede tener una distancia de trabajo inferior a 0,4mm, por lo que se han diseñado objetivos con una distancia de trabajo mayor. Éstos utilizan un elemento de lente negativo entre el objeto y el ocular, que tiene el atractivo adicional de proporcionar también un aplanamiento del campo. Estos objetivos son especialmente valiosos cuando se usan con sistemas de video.

En objetivos con capacidades de aumento iguales o superiores a 25X, los elementos aplanáticos en forma de menisco se diseñan en el objetivo del microscopio en el espacio entre el objeto y los pares de dobletes que realizan la transmisión de imágenes. Estos componentes aplanáticos tienen la propiedad de hacer converger la luz sin añadir aberración esférica a la imagen y proporcionan un aumento de la AN sin introducir una aberración significativa.

El objetivo de microscopio de mayor potencia disponible es el objetivo de inmersión. Cuando se utiliza este tipo de objetivo, se debe colocar una gota de aceite entre el objeto en el portaobjetos del microscopio y el objetivo. El aceite utilizado tiene un IR igual al del vidrio en el primer componente del objetivo.

El primer componente de los objetivos de inmersión es generalmente un hiperhemisferio, es decir, una pequeña superficie óptica con forma de hemisferio pero con una curva límite superior a los 180°. Esta actúa como acoplador aplanático entre el portaobjetos y el resto del objetivo del microscopio. Un objetivo de inmersión con una AN alta normalmente consta de un hiperhemisferio seguido de uno o dos colectores aplanáticos y luego dos o más conjuntos de dobletes. Dichos objetivos se fabrican con capacidades de aumento superiores a 50X, siendo el extremo de alrededor de 100X.

También hay disponibles, lentes de inmersión en agua. Tales lentes utilizan agua como líquido de inmersión y permiten a los biólogos examinar muestras en un medio acuoso sin la carga de un cubreobjetos que confina a los organismos vivos.

Revolver o nariz

El revolver o nariz es una pieza de tipo giratorio, que agrupa el sistema de lentes donde se ubican los objetivos. Constituye una pieza de gran ayuda que facilita el intercambio de objetivos, cuando se requiere de una ampliación diferente, cólo con girar su posición. Esto evita que los objetivos tengan que ser retirados y vueltos a colocar.

Brazo

El brazo, también llamado columna, es la parte del microscopio que permite la unión entre el tubo óptico, sistema mecánico para el escenario y la base o pie. Es el elemento más robusto del equipo y en ocasiones se lo aprovecha como jaladera.

Escenario o platina

El escenario o platina es una especie de bandeja plana, cuya principal función es permitir que se asiente o fije la muestra que se desea observar. Incorpora una abertura a través de la cual pasa la luz proveniente del condensador hacia la muestra. En un microsopio óptico, la platina o escenario constituye un mecanismo capaz de moverse sobre los dos ejes: de izquierda – derecha y, adelante – atrás.

Clip de sujeción

El clip de sujeción o pinza sujetadora se encuentra formando parte de la platina o escenario. Su función es la de fijar la muestra que se ubica en la platina.

Ajuste grueso

El ajuste grueso o tornillo macrométrico como también se lo conoce, es una perilla giratoria ubicada en torno al tornillo de ajuste fino. Su función es conseguir un enfoque rápido (aunque no tan preciso) de la muestra. Para esto, existe un mecanismo involucrado que incorpora un sistema de cremallera. Así se consigue un desplazamiento vertical uniforme.

Ajuste fino

El ajuste fino también llamado tornillo micrométrico, es básicamente una perilla giratoria, cuya manipulación permite un enfoque mucho más exacto de la muestra. El mecanismo involucrado genera un movimiento mucho más lento. Esto aporta mayor precisión al desplazamiento, que cuando se manipula el tornillo macrométrico.

Condensador

El condensador es la parte del microscopio que se ubica por debajo del escenario. Su función consiste en concentrar a luz, proporcionando una iluminación brillante y uniforme a la región del objeto que se quiera observar. Esta técnica de enfoque de luz se denomina “iluminación crítica”. De forma alternativa, también está el sistema de “iluminación de Köhler”, donde la imagen de la fuente se enfoca en el condensador, que a su vez se enfoca en la pupila de entrada del objetivo del microscopio. Este último tiene la ventaja de generar imágenes promediando la falta de uniformidad de la fuente. Algo muy importante, es que la luz de la fuente debe cubra el objeto y llene de luz la abertura de entrada del objetivo del microscopio.

Siguiendo con el tema del condensador, los primeros microscopios incluían una versión de una sola lente, misma que se fijaba en el extremo del instrumento frente a la lámpara, de la misma forma que en los microscopios de barril. También, se podía encontrarlo montado por debajo de la platina. Por supuesto, el paso del tiempo, permitió el desarrollo de diseños más complejos, así que se concibieron los condensadores acromáticos. Lamentablemente, estos estan enmarcados por ciertas dificultades de uso, en vista de que requieren un enfoque preciso y su distancia de trabajo es corta.

Además de los condensadores enunciados anteriormente, existen otros que se usan especialmente en aplicaciones específicas. Así tenemos, el condensador de fondo oscuro, o de campo oscuro, capaz de iluminar las muestras contra un fondo negro. Es eminentemente aplicable a la observación de estructuras tales como bacterias y células flageladas en el agua. El uso de filtros de color, mismos que se introdujeron a finales del siglo XIX por el microscopista británico Julius Rheinberg y ahora conocido como iluminación Rheinberg, permite practicar una forma de microscopía de fondo oscuro en la que el fondo y la muestra tienen colores contrastantes. Aunque esta técnica no tiene ningún beneficio para el diagnóstico, sí que los resultados pueden ser espectacularmente hermosos.

Diafragma

El diafragma constituye un elemento muy importante en cuanto a la constitución del microscopio. Su función es la de controlar la cantidad de luz direccionada hacia la muestra. Mientras más se cierra el diafragma, mayor será el contraste de la imagen visualizada.

Algo importante a saber, es que cuando los objetivos de un microscopio tienen poco poder de ampliación, es necesario un cierre del diafragma. Así se evita el ingreso de mucha luz. Por el contrario, cuando se dispone de un objetivo con alto poder de aumento, se requerirá de mayor incidencia de luz. En consecuencia, habrá que abrir el diafragma hasta encontrar el mejor ajuste, a fin de garantizar la mejor resolución posible.

Sistema de iluminación

El sistema de iluminación de un microscopio óptico estándar, está diseñado de tal forma que una luz se transmita a través de un objeto translúcido a fin de permitir su visualización. Actualmente existen versiones modernas de microscopios, las cuales incorpora una fuente de luz LED con un sistema de lentes que conforman el condensador.

Base

La base o también llamada pie, es básicamente la parte inferior sobre la cual se asienta el microscopio. Su función es aportar fijeza y equilibrio al equipo a fin de garantizar su estabilidad. La forma más recurrente de la base es en Y o rectangular.

Profundidad de enfoque de un microscopio óptico

El gran AN de un objetivo de microscopio restringe los requisitos de enfoque del objetivo. A continuación adjuntamos una tabla donde se indica la profundidad de enfoque con la precisión con la que se debe ubicar el plano focal en una dirección a lo largo del eje de la óptica del microscopio para que se pueda obtener la mayor resolución posible.

Máximo poder de resolución y profundidad de enfoque para un microscopio óptico

Proceso de formación de imágenes en un microscopio

Un cúmulo de rayos de luz es transmitido desde cada punto del objeto hacia el objetivo del microscopio. Este último traduce tales haces de luz en imágenes que se reproducen en el plano focal frontal del ocular.

En la formación de imágenes intervienen ciertas reglas convencionales de trazado de rayos. Así tenemos que, en ausencia de aberración, los rayos geométricos forman una imagen puntual de cada punto del objeto. En presencia de aberraciones, cada punto del objeto está representado por un punto indistinto. El ocular está diseñado para visualizar los rayos en un punto focal a una distancia conveniente para ver la imagen.

En este sistema, el brillo de la imagen está determinado por los tamaños de las aperturas de las lentes y por la apertura de la pupila del ojo. La distancia focal y el aumento resultante del objetivo deben elegirse para lograr la resolución deseada del objeto en un tamaño conveniente para ser visualizado a través del ocular. La formación de imágenes en el microscopio puede complicarse por la difracción y la interferencia que tienen lugar en el sistema de imágenes y por el requisito de utilizar una fuente de luz que se refleja en el plano focal.

La teoría moderna de la formación de imágenes en el microscopio se dio en el año de 1.873 por el físico alemán Ernst Abbe. El punto de partida de la teoría de Abbe es que los objetos en el plano focal del microscopio están iluminados por la luz convergente de un condensador. La luz convergente de la fuente se puede considerar como una colección de muchas ondas planas que se propagan en un conjunto específico de direcciones y se superponen para formar la iluminación incidente. Cada una de estas ondas planas efectivas es difractada por los detalles en el plano del objeto. Es decir, que cuanta más pequeña es la estructura detallada del objeto, más amplio es el ángulo de difracción.

La estructura del objeto se puede representar como una suma de componentes sinusoidales. La rapidez de variación en el espacio de los componentes se define por el período de cada componente, o la distancia entre picos adyacentes en la función sinusoidal. La frecuencia espacial es el recíproco del período. Cuanto más finos sean los detalles, mayor será la frecuencia espacial requerida de los componentes que representan el detalle del objeto. Cada componente de frecuencia espacial produce difracción en un ángulo específico que depende de la longitud de onda de la luz. Como ejemplo, los componentes de frecuencia espacial que tienen un período de 1μm tendrían una frecuencia espacial de 1000 líneas por milímetro. El ángulo de difracción de dicho componente para la luz visible con una longitud de onda de 550nm será de 33,6°. El objetivo del microscopio recoge estas ondas difractadas y las dirige a un plano de imagen, donde la interferencia entre las ondas difractadas produce una imagen del objeto.

Ahora, debido a que la apertura del objetivo es limitada, no todas las ondas difractadas del objeto pueden ser transmitidas por el objetivo. Ernst Abbe demostró que cuanto mayor es el número de ondas difractadas que alcanzan el objetivo, más fino es el detalle que se puede reconstruir de la imagen. Designó el término apertura numérica “AN” como la medida de la capacidad del objetivo para recoger la luz difractada y, por lo tanto, también de su poder para resolver los detalles. Sobre esta base, es obvio que cuanto mayor sea el aumento del objetivo, mayor será la AN requerida del objetivo. La AN más grande teóricamente posible en el aire es 1,0, pero las limitaciones del diseño óptico limitan la AN que se puede lograr a alrededor de 0,95 para objetivos secos.

Para el ejemplo anterior de un espécimen con una frecuencia espacial de 1000 líneas por milímetro, el AN requerido para recolectar la luz difractada sería 0.55. En consecuencia, se debe usar un objetivo de AN 0,55 o mayor, para observar y recopilar datos útiles de un objeto con detalles separados por 1μm. Si el objetivo tiene un AN más bajo, los detalles del objeto no se resolverán. Los intentos de ampliar los detalles de la imagen mediante el uso de un ocular de alta potencia no aumentarán la resolución. Esta última condición se llama magnificación vacía.

Algo muy importante que hay que saber, es que la longitud de onda de la luz se acorta cuando se propaga a través de un medio denso. Para resolver los detalles más pequeños posibles, los objetivos de inmersión pueden recoger la luz difractada por detalles más finos que los objetivos en el aire. El NA se multiplica por el índice de refracción del medio, y son posibles AN de trabajo de 1,4. En los mejores microscopios ópticos se pueden observar estructuras con una frecuencia espacial tan pequeña como 0,4μm. Tenga en cuenta que se ha demostrado que las lentes individuales fabricadas por Leeuwenhoek son capaces de resolver fibrillas de solo 0,7μm de espesor.

Captura de imágenes en un microscopio

Actualmente, muchos de los microscopios incluyen algún método de captura de imágenes. Este puede ser un sistema de registro fotográfico (método antiguo) o en un sistema de captura digital. Este último, consiste en quitar el ocular y colocar una cámara digital en el plano focal del ocular, interceptando así la imagen del objetivo directamente. Con la innovación tecnológica, cada vez es más frecuente el uso de un detector electrónico, como un semiconductor complementario de óxido de metal “CMOS” o un chip de dispositivo de acoplamiento de carga “CCD” para capturar la imagen ampliada como una señal digital. Esta señal puede transmitirse a una computadora para ser visualizada a través del monitor. Un software de gestión, permite al usuario tomar fotografías, secuencias de video o secuencias de lapso de tiempo. Los mismos que se pueden guardar y/o editar con diversas finalidades.

El análisis del tamaño, así como la distribución del área y de las partículas se realiza fácilmente por medios analíticos convencionales, una vez que las imágenes han sido capturadas digitalmente. La producción de presentaciones por computadora, la transmisión por correo electrónico y la facilidad de impresión son beneficios que los sistemas descritos ofrecen a los usuarios, hoy en día.

Tipos de microscopios

El tipo de microscopio más común es el microscopio óptico, mismo que enfoca luz visible a través de lentes para conseguir su objetivo de ampliación. Sin embargo, también existen versiones de microscopios que amplían las imágenes utilizando una variedad de tipos de onda. Su trabajo consiste en convertir la información conseguida en imágenes tanto directas como digitales, sean estas estáticas o dinámicas. Así tenemos, aquellos que echan mano de ondas acústicas, rayos X o haces de electrones.

Microscopios ópticos

El microscopio óptico también llamado microscopio de luz, es el tipo más común y por ende el más conocido. Utiliza lentes de vidrio para conseguir la ampliación de las imágenes y pueden ser básicos (de una sola lente) o complejos (de varios lentes).

Historia de los microscopios ópticos

El origen de los microscopios ópticos se remonta al tiempo en que se comprendió el concepto del aumento o ampliación de las imágenes. La llegada de las lupas y anteojos allanó el camino para la aparición de los microscopios ópticos propiamente dichos. Es así, que en torno al año 1.590 entran en escena Hans Jansen, su hijo Zacharias Jansen y Hans Lippershey, tres fabricantes de anteojos a los que se les adjudica la invención del primer microscopio compuesto. Mientras que la representación que incluía un ocular y una lente objetivo se concibió hasta 1.631. Los primeros ejemplares del microscopio óptico se confeccionaron en madera y cartón, con frecuencia adornados con piel pulida de pescado, y se popularizaron a mediados del siglo XVII.

Uno de los usuarios más ilustres del naciente microscopio óptico fue Robert Hooke. Este filósofo inglés aprovechó las características del equipo en cuestión, a fin de ofrecer demostraciones para la Nueva Real Sociedad. Dichas demostraciones dieron inicio allá por el año de 1.663. Para 1.665 es publicada la obra “Micrographia” un folio elaborado por Hooke, en el que se incluía imágenes de vistas microscópicas de insectos y elementos de nuestro entorno como piojos, pulgas y ciertas plantas. Justamente fue dicho volumen de folio, el que introdujo al mundo el término “célula”.

Posteriormente e inspirado por el trabajo de Hooke, en 1.670 Antonie Van Leeuwenhoek, un funcionario holandés, comenzó sus observaciones de microorganismos de agua dulce. Van Leeuwenhoek construyó manualmente pequeñísimos microscopios con los que pudo obtener imágenes de elementos con dimensiones de hasta 0,7μm. Tal logro dio inicio a la microbiología en torno al año 1.674, rama de la ciencia a la que también se adhirieron ilustres botánicos como el escocés Robert Brown, quien demostró la ubicuidad del núcleo celular en 1.831.

En 1.733, el óptico inglés aficionado Chester Moor Hall descubrió por ensayo y error que una combinación de una lente de vidrio de corona convexa y una lente de vidrio de pedernal cóncava podían ayudar a corregir la aberración cromática. Tal circunstancia daba una solución al efecto de colores espurios propios de los microscopios simples de lentes individuales.

En 1.774 Benjamin Martin produjo un conjunto pionero de lentes con corrección de color para un microscopio.

En años posteriores, con una mejor comprensión de la óptica que da formación a las imágenes, se fueron alcanzando grandes mejoras en torno al microscopio óptico. Es así que el holandés Francois Beeldsnijder introduce a finales del siglo XVIII un objetivo sin distorsión de color denominado “objetivo acromático”. Posteriormente llegado el año de 1.830, sería el inglés Joseph Jackson Lister quien publica un trabajo que describe un enfoque teórico para el diseño completo de objetivos de microscopio.

En 1.868 el físico alemán Ernst Abbe inventó un sistema de lentes apocromáticas, que tenían incluso mejor corrección de color que las lentes acromáticas, publicando 5 años más tarde un análisis exhaustivo de la teoría de las lentes.

Ya en el siglo XIX los microscopios ópticos alcanzaron los límites efectivos de la microscopía óptica. Los instrumentos posteriores, como los microscopios de contraste de fase, los microscopios de interferencia y los microscopios confocales, resolvieron problemas específicos que habían surgido durante el estudio de muestras como las células vivas.

Microscopio óptico simple

Los microscopios ópticos simples, tal como su nombre sugiere, son aquellos que están formados por una única lente. El ejemplar más común de la presente clasificación es la lupa de mano, la cual puede llegar a ofrecer una amplificación de entre 3 y 20 veces. Sin embargo existen también microscopios simples de una sola lente capaces de ampliar hasta 300 veces el tamaño de una imagen. Así, permiten visualizar gérmenes o elementos de hasta 1μm.

Microscopio óptico compuesto

Los microscopios ópticos compuestos están constituidos por varios elementos ópticos y utilizan luz visible como fuente de iluminación. Pueden permitir una amplificación que rodea las 2000 veces, lo que posibilita observar objetos de de hasta 0,2μm. Dicho aumento es posible, gracias a que la luz provista por la fuente luminosa pasa a través de un condensador, mismo que incorpora los lentes que dirigen la luz por entre la muestra. Entonces, los rayos de luz son direccionados hacia el interior del lente objetivo, de donde pasan hacia el ocular, donde consiguen la ampliación final.

Los microscopios ópticos compuestos son capaces de superar las limitaciones en cuanto a resolución y aumento de los microscopios simples. Lo consiguen mediante el uso de dos conjuntos de lentes. Por una parte está el conjunto del o de los objetivos que manejan una distancia focal corta y se ubican en una posición cercana al objeto que se requiere examinar. Los objetivos forman una imagen real en el plano focal frontal del segundo conjunto de lentes denominados oculares. El ocular u oculares tienen la función de generar una imagen virtual ampliada, la cual puede ser visualizada por el observador.

En base a lo descrito anteriormente, se puede deducir entonces, que la capacidad de aumento de los microscopios compuestos, está definida por la magnificación que ofrezcan tanto las lentes del objetivo como las de los oculares.

Los microscopios ópticos compuestos incluyen un cuerpo tubular que alberga el objetivo, el o los oculares, un lente oscuro que hace de condensador, una platina, un sistema de iluminación y un mecanismo de enfoque (generalmente grueso y fino).

Microscopio óptico compuesto monocular

Consituye la forma más básica del microscopio óptico compuesto. Se conforma por un cuerpo de un solo tubo, donde el objetivo u objetivos se sitúan en uno de los extremos y un único ocular en el otro extremo.

Microscopio óptico compuesto binocular

Como es de suponer, el microscopio óptico compuesto binocular incorpora dos oculares, mismos que permiten la visualización con los dos ojos. Tal recurso facilita el trabajo del observador haciéndolo más cómodo y natural. Constitucionalmente, la presente variación de microscopio puede emplear un solo tubo binocular equipado con prismas divisores. Así, se consigue direccionar la mitad de la imagen procedente del objetivo, a cada ojo. El mecanismo del prisma forma parte de un conjunto mecánico giratorio. Esto, a fin de hacer coincidir la distancia de separación de los oculares con la distancia interpupilar requerida por el observador.

Microscopio óptico compuesto trinocular

Los microscopios ópticos compuestos trinoculares incorporan tres oculares. Tal configuración, permite que el observador lo use como si se tratara de un microscopio binocular. Sin embargo, la ventaja adicional del presente microscopio radica en que se puede conectar un dispositivo de captura de imagen y/o video en el tercer ocular. Así, se puede transferir las imágenes hacia otros sistemas de almacenamiento y proyección, como computadores, laptops y monitores.

Los microscopios trinoculares evitan en gran manera el cansancio visual. Además, facilitan la gestión de imágenes, ya sea para una exposición grupal o para crear un registro o historial.

Constitucionalmente, se diferencian de los microscopios binoculares en que el prisma que generalmente forma parte del cabezal, divide la luz proveniente del objetivo en tres haces idénticos. Así se consigue que la imagen visualizada por el observador a través de los oculares, sea la misma que se extraiga a través del tercer ocular.

Microscopio de campo oscuro

Los microscopios de campo oscuro son utilizados especialmente en aplicaciones de tipo biológico. Incorporan un tipo de condensador que consigue una iluminación lateral. Entonces, las lentes reciben únicamente la luz dispersada por los componentes celulares, dando lugar a lo que se conoce como “fenómeno Tyndall”. Dicho fenómeno da como resultado, la apariencia brillante de las estructuras celulares en contraste con un fondo oscuro.

En un microscopio de campo oscuro, la iluminación puede ser de forma transmitida o incidente. Si la iluminación es transmitida, la parte central del rayo de luz queda ocluida por una lámina o lente añadida en la trayectoria (al interior del condensador) antes de la muestra. En cambio, si se trata de una iluminación incidente, habrá la necesidad de un condensador cuya superficie central tenga la forma de una parábola. De tal forma, que la luz se refleje tanto lateral como periféricamente hacia un espejo, y todo, con el ángulo de inclinación adecuado, a fin de que un cono de luz sea dirigido lacia la muestra.

Microscopio de contraste de fases

Los microscopios de contraste de fases aprovechan las mínimas diferencias del índice de refracción de las distintas partes de los elementos orgánicos, como células o tejidos. Tales diferencias de refracción son ampliadas, permitiendo que su intensidad sea visible. Así se consigue que las preparaciones citológicas e histológicas puedan ser observadas sin ser sometidas al proceso de tinción.

Microscopio de polarización

Los microscopios de polarización utilizan un tipo de luz que vibra en un solo plano, conocida como luz polarizada, a fin de iluminar la muestra. Para hacer esto posible, los microscopios en cuestión incorporan un prisma que deja pasar únicamente luz polarizada hacia la muestra. Además, poseen un filtro localizado por sobre la ubicación de la muestra. Así, ambos elementos pueden orientarse, de tal forma que, si sus secciones principales llegasen a cortarse perpendiculafrmente, la luz que pasa por el polarizador no llegue a atravesar el analizador.

Los microscopios de polarización se aplican en el estudio de tejidos duros como huesos y piezas dentales. Asimismo, tejidos musculares y órganos vegetales lignificados.

Microscopio invertido

Los microscopios invertidos son aquellos cuyo sistema de iluminación y condensador se encuentra ubicado por sobre la platina, mientras que el revolver se encuentra ubicado por debajo de la misma. Tal configuración invertida respecto de lo tradicional, permite mayor distancia de trabajo y la posibilidad de visualizar el crecimiento periódico de células en cultivos entre otras cosas.

Microscopio estereoscópico

Los microscopios estereoscópicos binoculares son en realidad un par de microscopios emparejados, montados uno al lado del otro con un pequeño ángulo entre los ejes ópticos. En este tipo de microscopios, el objeto se refleja de forma independiente para cada ojo y se mantiene el efecto estereoscópico que permite la discriminación del relieve en el objeto. El efecto puede magnificarse con la elección adecuada de los parámetros de diseño de los microscopios. Por razones prácticas, el poder de aumento de tales instrumentos suele estar en el rango de 5X a 250X. Dichos microscopios son importantes en cualquier trabajo en el que se deba realizar un ajuste fino de herramientas o dispositivos. Por ejemplo, en laboratorios biológicos para realizar disecciones o en la salas de operaciones para procedimientos microquirúrgicos.

El uso de los microscopios estereoscópicos de aumento moderado es mayor en la industria de fabricación de productos electrónicos, o servicios de reparación de los mismos. Esto debido a que permiten a los técnicos visualizar elementos microelectrónicos difíciles de manipular y/o visualizar a simple vista.

Microscopio de polarización

Los microscopios de polarización son microscopios convencionales que incorporan características adicionales, lo que permite la observación bajo luz polarizada. La fuente de luz en este tipo de microscopios está equipada con un filtro polarizador, de modo que la luz que suministra está polarizada linealmente. Dicho de otra forma, las ondas de luz vibran en una dirección dada en lugar de aleatoriamente en todas las direcciones, como en la luz ordinaria.

Entonces, cuando esta luz polarizada linealmente pasa a través del objeto que se desea visualizar, puede no verse afectada o, si el objeto es birrefringente, puede dividirse en dos haces con diferentes polarizaciones. Un segundo filtro es el analizador de polarización, el cual se coloca en el ocular, donde bloquea todas las polarizaciones de la luz excepto una. El analizador se puede girar para obtener el máximo contraste en la imagen, y así se puede determinar la dirección de polarización de la luz transmitida a través del objeto. El ocular también se puede equipar con un retardador de polarización, lo cual cambia la fase de la luz entre las direcciones de polarización seleccionadas, permitiendo así, girar para medir la cantidad de polarización elíptica producida por la muestra.

Cabe anotar, que se deben tomar muchas precauciones en el diseño y construcción de un microscopio de polarización, a fin de evitar el uso de componentes ópticos que introduzcan un retardo de polarización indeseable en el haz de luz, después de que ha dejado el objeto. Existe una limitación básica que se impone al uso de objetivos con AN elevadas en los que los altos ángulos de incidencia necesarios en la superficie producen cierta despolarización. Se han diseñado y producido objetivos de microscopio especializados que minimizan este efecto. Los microscopios de polarización se utilizan principalmente para examinar la naturaleza de los cristales en muestras geológicas y para analizar los detalles de la birrefringencia y la tensión en las estructuras biológicas.

Microscopio metalográfico

Los microscopios metalográficos se utilizan para identificar defectos en superficies metálicas, para determinar los límites de los granos de cristal en aleaciones metálicas y para estudiar rocas y minerales. Este tipo de microscopios emplean iluminación vertical, en la que la fuente de luz se inserta en el tubo del microscopio, por debajo del ocular, a través de un divisor de haz. La luz entonces brilla a través del objetivo y se enfoca a través del objetivo sobre la muestra. La luz reflejada o dispersada hacia el objetivo luego se refleja en el ocular. De esta manera, los objetos opacos, como los metales, pueden examinarse bajo el microscopio. Dichos sistemas también tienen aplicaciones en ciencia forense y microscopía de diagnóstico.

Microscopio de fluorescencia

Los microscopios de fluorescencia son capaces de detectar cierto tipo de moléculas, que absorben determinadas longitudes de onda de luz para luego emitirla en una mayor longitud de onda. Una de las principales características del presente microscopio, es la de integrar una fuente de luz de gran intensidad en combinación con un sistema de doble filtro. Básicamente su trabajo consiste en dejar pasar únicamente la luz de la longitud de onda necesaria para exitar las moléculas fluorescentes que se desean visualizar. Así se consigue, que tales estructuras resalten por sobre un fondo oscuro.

Microscopio reflector

Los microscopios reflectores cuentan con objetivos que reflejan en lugar de refractar. Son útiles para una amplia gama de luz visible y especialmente en las regiones ultravioleta o infrarroja, donde los lentes ópticos convencionales no transmiten. El objetivo del microscopio reflector por lo general consta de un espejo primario cóncavo relativamente grande y un espejo secundario convexo más pequeño, mismo que se ubica entre el espejo primario y el objeto. Este último sirve para transmitir la imagen del espejo primario al plano focal del ocular.

Aunque los objetivos reflectantes no tienen aberración cromática, es necesario corregir las aberraciones esféricas, ya sea mediante el uso de componentes reflectantes asféricos o agregando lentes de refracción apropiados.

Microscopio de contraste de fases

Los microscopios de contraste de fases permite la visualización de células sin un previo proceso de coloreado, lo que resulta especialmente útil en el caso de células vivas.

Existen innumerables elementos biológicos de interés. Muchos consisten de estructuras celulares como núcleos que son casi transparentes. En consecuencia, transmiten tanta luz como el medio de montaje que los rodea. Esto, debido a que no hay contraste de color o transmisión en dicho objeto, por lo que no es posible observar tales estructuras usando un microscopio óptico convencional.

Ahora, es posible aprovechar la diferencia de IR de la estructura celular, el cual varía ligeramente del material circundante. La propagación de la luz a través tales estructuras, proporciona un cambio en la trayectoria óptica a través del objeto, así como un cambio resultante en la fase de la luz que ha pasado a través de la estructura de interés en relación con la luz que pasa alrededor de la estructura. Esta información de cambio de fase se puede utilizar para formar una imagen visible, si se convierte en variaciones de intensidad detectables por el observador.

En el año de 1.934, el físico holandés Frits Zernike desarrolló un método para conseguir lo anteriormente explicado. Esto es, un microscopio de contraste de fases. La diferencia de fase entre la luz que es difractada por una muestra y la luz directa, es un cuarto de longitud de onda o menos. Al colocar una máscara adecuada en el plano focal posterior del objetivo para proporcionar un filtrado selectivo de la luz difractada, Zernike aumentó esta diferencia de fase en otro cuarto de longitud de onda. Las ondas que difieren en fase en la mitad de una longitud de onda se cancelan entre sí. En los lugares de la imagen de fase donde esto ocurre, no se transmite luz. Como resultado, las diferencias de fase provocadas por variaciones en la muestra aparecen como variaciones de intensidad en la imagen.

Existen varios enfoques para lograr una imagen de buena calidad mediante esta técnica. Uno de los más comunes es el uso de una fuente de luz anular reflejada en una máscara anular en el plano focal posterior. Otras técnicas usan bordes, pequeños puntos u otras combinaciones de forma de fuente y forma de máscara.

Microscopio de interferencia

Los microscopios de interferencia son aquellos que se utilizan en la microscopia de interferencia. Lo que sucede, es que, aunque todos los microscopios ópticos en sentido estricto crean imágenes por difracción, la microscopía de interferencia crea imágenes utilizando la diferencia entre un haz de interferencia no modificado por la muestra y un haz idéntico que lo ilumina. ¿Cómo lo hace? Bien, un divisor de haz divide la luz en dos caminos, entonces, uno de los haces pasa a través de la muestra mientras que el otro lo desvía. Cuando estos dos se combinan, la interferencia resultante entre ellos revela la estructura de la muestra.

El primer sistema exitoso, fue inventado por el microscopista británico Francis Smith y el físico francés Maurice Françon, allá por el año de 1.947. Tal sistema usaba lentes de cuarzo para producir haces de referencia y formadores de imágenes polarizados perpendicularmente. Ahora, si bien es cierto que aquello funcionó bien para especímenes continuos, en el caso de partículas era mejor hacer que el haz de referencia pasara a través de un área desnuda de la preparación del espécimen. Hubo que esperar hasta 1.950 para que el uso de superficies medio plateadas y portaobjetos ligeramente ahusados ​​permitieran que la luz polarizada fuera prescindida.

Mientras tanto, el contraste de interferencia diferencial “CID” fue desarrollado por el físico francés nacido en Polonia Georges Nomarski en el año de 1.952. Un prisma Wollaston de división de haz emite dos haces de luz polarizada. Estos están polarizados en un plano en ángulo recto entre sí y que divergen ligeramente. Los rayos se enfocan en el plano posterior del objetivo, donde pasan a través de un prisma compuesto que es isótropo en el punto medio, con una diferencia de trayectoria óptica creciente alejándose del punto medio. El color de fondo de la imagen depende de la configuración del prisma, que se puede deslizar longitudinalmente para producir un espectro de colores que varía a través del espectro hasta el negro. La sensibilidad es mayor en la posición intermedia, pero el contraste de color es mayor cuando se selecciona un tinte de fondo fuerte. Los desarrollos más recientes incluyen el contraste de iluminación asimétrica y el contraste de modulación, que aprovechan la iluminación oblicua o compensada.

Los microscopios de interferencia encuentran aplicación en las áreas de biología, cristalografía, mineralogía y química.

Microscopio de barrido confocal

Los microscopios confocales son aquellos que utilizan una técnica óptica de imagen, a fin de conseguir tanto un mayor contraste como la reconstrucción de imágenes tridimensionales. Lo anterior se consigue eliminando la luz desenfocada en especímenes más gruesos que el plano focal, mediante el uso de un colimador de orificio delimitante llamado “pinhole”.

Lo que sucede, es que el campo de visión de un microscopio está limitado por la óptica geométrica y por la capacidad de diseñar ópticas que proporcionen una corrección de aberración constante en un gran campo de visión. Entonces, si se utiliza una disposición de escaneo, el objetivo se puede utilizar sobre una serie continua de campos pequeños. Así, los resultados se pueden utilizar para construir una imagen de una región más grande.

Tal concepto se ha aprovechado en el microscopio de barrido confocal. La característica principal de la microscopía confocal es que solo se detecta lo que está enfocado y todo lo que está fuera de foco aparece en negro. Esto se logra enfocando la fuente de luz, generalmente un láser en un punto, y detectando la imagen a través de un agujero de alfiler. Dado que solo la luz del punto enfocado contribuye a la imagen final en un sistema confocal, es particularmente útil para eludir estructuras finas y tridimensionales de especímenes biológicos.

En un microscopio confocal de barrido láser “LSCM”, el punto focal de un láser se escanea a través de una muestra para construir una sección óptica bidimensional. Las imágenes tridimensionales se pueden reconstruir tomando una serie de imágenes bidimensionales a diferentes profundidades focales en la muestra, las cuales son conocidas como series Z. Los láseres de argón y kriptón/argón se utilizan comúnmente, y se ha diseñado un sistema multifotónico en el que un láser de argón excita un zafiro de titanio sintético. Por lo tanto, se puede utilizar una gama de colores.

Las muestras se distinguen por la fluorescencia. Algunos componentes emiten fluorescencia espontáneamente, pero la mayoría se tiñen con tintes que emiten fluorescencia bajo los rayos de un láser. Las velocidades de escaneo pueden ser altas. En algunos sistemas, se escanea una línea de imagen cada 0,488 milisegundos, por lo que se puede ensamblar fácilmente una secuencia de imágenes que muestran cómo cambia una muestra con el tiempo. Métodos como estos se utilizan para estudiar el comportamiento de las células vivas.

Microscopio de luz ultravioleta

Los microscopios de luz ultravioleta son similares a los microscopios ópticos convencionales, pero con la diferencia que no utilizan luz visible sino luz ultravioleta.

La microscopía de luz ultravioleta “UV” fue introducida a principios del siglo XX por los científicos alemanes August Köhler y Moritz von Rohr. La luz ultravioleta tiene una longitud de onda inferior, lo que permite una mayor resolución. Sin embargo, la opacidad de las lentes de vidrio convencionales a tales longitudes de onda, requieren el uso de un microscopio reflector o lentes de cuarzo especialmente fabricados. Los microscopios UV se utilizaron más ampliamente para la microscopía fluorescente, en la que los rayos UV provocaban la fluorescencia de las manchas del microscopio.

En la microscopía moderna, las lámparas en el rango desde el azul profundo hasta el ultravioleta cercano se usan con mayor frecuencia para este propósito. Sin embargo, el interés por la luz ultravioleta llevó al reconocimiento de que el haz de electrones podía utilizarse como fuente de iluminación de longitud de onda muy corta. Justamente fue esto lo que dio lugar al interés por el microscopio electrónico.

Microscopios electrónicos

Los microscopios electrónicos son aquellos que aprovechan la naturaleza ondulatoria de varios procesos físicos. La variedad más común de los microscopios electrónicos utilizan un haz de electrones para la conformación de las imágenes.

Microscopio electrónico de transmisión “TEM”

Los microscopios electrónicos de transmisión (TEM) pueden generar imágenes que superan la amplificación de 1.000.000X. Gracias a esto, permiten obtener imágenes de especímenes delgados, típicamente secciones, en un vacío cercano.

Microscopio electrónico de barrido “SEM”

Los microscopios electrónicos de barrido (SEM) son capaces de generar una imagen reflejada de relieve en una muestra contorneada. Los SEM tienen generalmente una resolución más baja que un TEM pero con la ventaja, de que pueden mostrar superficies sólidas de una manera realmente única.

Microscopio electrónico de barrido ambiental “ESEM”

Los microscopios electrónicos de barrido ambiental se diferencian de los microscopios electrónicos convencionales, en que no requieren de un gas en la cámara de muestra del MEBE. Tal particularidad, constituye una ventaja cuando de evitar el estrés por vacío se trata. Los ESEM se utilizan principalmente para el estudio de muestras no conductoras.

Microscopio de escaneo laser “LSM”

Los microscopios de escaneo laser son capaces de escanear muestras, punto por punto. Esto permite obtener un corte óptico en 2D en base al cual se puede construir imágenes 3D muy precisas. El uso de los presentes microscopios se da principalmente en la investigación biológica.

Microscopio Acústico de barrido “SAM”

 Los microscopios acústicos de barrido son dispositivos de inspección, capaces de generar una imagen del interior de un objeto, a partir del uso de sonidos enfocados. Este tipo de microscopios son utilizados generalmente con el objetivo de evaluar y encontrar fallos, grietas y delaminaciones estructurales, de una forma no destructiva.

Microscopio de rayos X “TXM”

Los microscopios de rayos X echan mano de la radiación electromagnética de la banda de rayos X para la generación de imágenes ampliadas de un objeto. Su ventaja respecto de los microscopios convencionales, radica en que el nivel de detalle de las imágenes logradas, simplemente no tiene comparación. Por tanto, los TXM son usados a fin de visualizar la estructura y composición química de una variedad de materiales.

Microscopio de túnel de barrido “STM”

Los microscopios de túnel de barrido permiten visualizar átomos individuales. Esto, gracias a su capacidad de resolución lateral de 0,1nm y 0,01nm de resolución de profundidad. Los STM basan su funcionamiento en lo que se denomina efecto túnel, y se utilizan especialmente para obtener imágenes de superficies, dentro del rango atómico.

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